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Test immuno-enzymatique du fipronil (ELISA) Mode d'emploi du kit Ce kit est uniquement destiné à la recherche. 1 Finalité d'utilisation : Ce kit est utilisé pour la détection quantitative des résidus de fipronil dans les aliments, les poissons, les crevettes et les tissus carnés (tels que le poulet, le bœuf et le porc), les œufs, le miel, le lait, le sérum et l'urine. 2 Principe expérimental Ce kit adopte la méthode ELISA compétitive. La plaque de micropuits est recouverte d'antigène couplé au fipronil, un étalon de fipronil ou un échantillon est ajouté, le fipronil libre est pré-revêtu d'antigène couplé au fipronil sur la bandelette de micropuits. bleu à jaune après ajout de la solution d'arrêt, utiliser un lecteur de microplaques pour détecter à 450 nm de longueur d'onde, l'absorbance et la teneur en fipronil dans l'échantillon Inversement proportionnelle, la teneur en fipronil dans l'échantillon a été calculée à partir de la courbe standard. 3 Composition du kit 3.1 La plaque ELISA détachable pré-enduite d'antigène couplé au fipronil : 1 pièce (12 puits × 8 barrettes). 3.2 Fipronil standard : 6 flacons (1ml/flacon), les contenus sont : 0 ppb, 0,1 ppb, 0,3 ppb, 0,9 ppb, 2,7 ppb, 8,1 ppb. 3.3 Conjugué enzymatique anticorps anti-fipronil : 1 flacon (6 ml). 3.4 Solution de développement de couleur A : 1 flacon (6 ml). 3.5 Fluide révélateur de couleur B : 1 flacon (6 ml). 3.6 Solution d'arrêt : 1 flacon (6 ml), acide sulfurique 2M. 3.7 Diluant d'échantillon : 1 flacon (10 ×, 6 ml), utilisé pour la dilution de l'échantillon. 3.8 Liquide de lavage concentré : 1 flacon (20×, 20 ml), utilisé pour le lavage des plaques. 3.9 Une feuille d'instructions. 4 Matériel nécessaire mais non fourni 4.1 Équipement 4.1.1 Lecteur de microplaques avec une longueur d'onde de 450 nm. 4.1.2 Concasseur. 4.1.3 Cylindre de mesure. 4.1.4 Oscillateur. 4.1.5 Entonnoir. 4.1.6 Whatman No 1 ou papier filtre équivalent. 4.1.7 Micropipette. 4.2 Réactifs 4.2.1 Eau déminéralisée ou eau distillée. 4.2.2 Méthanol. 5 stockage 5.1 Le kit est stocké à 2 ~ 8℃, ne pas congeler 5.2 Les microplaques non utilisées doivent être scellées et stockées au sec 6 questions nécessitant une attention 6.1 Veuillez lire attentivement les instructions avant d'utiliser le kit. 6.2 Ne pas utiliser de kits périmés. 6.3 Avant d'utiliser le kit, remettre les réactifs à température ambiante (25±2°C). Il est recommandé de revenir à la température pendant au moins 2 heures. 6.4 Le produit standard contient du fipronil, des précautions particulières doivent donc être prises lors de son utilisation et des gants doivent être portés pendant l'opération. 6.5 La solution d'arrêt contient de l'acide sulfurique, qui empêche les brûlures de la peau et la corrosion des vêtements pendant l'utilisation. 6.6 Les embouts pour différents standards et échantillons ne peuvent pas être mélangés, sinon les résultats du test seront affectés. 6.7 Les réactifs des kits de numéros de lots différents ne doivent pas être mélangés ; les pointes utilisées pour différents standards et échantillons ne doivent pas être mélangés, sinon cela affectera les résultats expérimentaux. 6.8 Le diluant d'échantillon dans ce kit doit être utilisé lors de la dilution de l'échantillon, sinon cela affectera les résultats expérimentaux 6.9 La formation de mousse doit être évitée lors du mélange des réactifs. 7 Préparation du fluide de travail 7.1 Solution étalon de fipronil : 0 ppb, 0,1 ppb, 0,3 ppb, 0,9 ppb, 2,7 ppb, 8,1 ppb 7.2 Liquide de lavage concentré : Diluer 1:20 (1+19) avec de l'eau distillée pour utilisation 7.3 Diluant d'échantillon : Diluer 1:10 (1+9) avec de l'eau distillée pour utilisation 7.3 Agent chromogène : réservé, éviter la lumière directe 7.4 Solution d'arrêt de réaction : prête à l'emploi 8 Procédures de traitement des échantillons (les échantillons doivent être utilisés strictement conformément aux instructions pendant le processus d'extraction, et le processus d'extraction doit être dilué avec précision, sinon les résultats seront inexacts, les échantillons doivent être conservés dans un endroit frais et sombre et réfrigérés) 8.1 Prélever 10 g d'échantillon broyé et ajouter 20 ml de solution de méthanol à 70% 8.2 Vibrer vigoureusement pendant 3 minutes 8.3 Filtre avec papier filtre Whatman No 1 8.4 Prélever 25 µl de l'échantillon traité et ajouter 25 µl de diluant d'échantillon au puits de réaction (le facteur de dilution de l'échantillon est de 2) 9 étapes du dosage immunoenzymatique 9.1 Instructions expérimentales 9.1.1 Veuillez remettre complètement tous les réactifs à l'extérieur de la boîte à température ambiante (25 ± 2 °C) avant que l'expérience ne commence pendant environ 2 heures. Après réchauffement à température ambiante (25 ± 2 (25), sortez les bandes microporeuses, refermez les bandes microporeuses en excès et stockez-les immédiatement à 2 ~ 8 Remarque : Assurez-vous que le retour de température est suffisant, sinon la précision et la précision de la détection seront affectées. 9.1.2 Veuillez remettre le réactif à 2 ~ 8 pour le stockage immédiatement après utilisation 9.1.3 Veuillez ne pas modifier le programme d'analyse 9.1.4 Veuillez utiliser une micropipette précise 9.1.5 Une fois l'opération démarrée, veuillez ne pas interrompre un programme 9.1.6 La reproductibilité des résultats ELISA dépend grandement des procédures opératoires, veuillez opérer en stricte conformité avec les exigences 9.1.7 Afin d'éviter la contamination croisée, chaque étalon et échantillon doit être rempli avec des embouts différents 9.1.8 Ne laissez pas la pointe de la pipette toucher la solution ou la surface interne du micropuits lors de l'ajout d'échantillons 9.2 Étapes d'analyse 9.2.1 Numérotation à l'avance, marquage de la pos ition de B0, des étalons et des échantillons, il est recommandé d'effectuer une détection à double trou 9.2.2 Prenez le nombre requis de micropores (les bandes de micropores peuvent être retirées), refermez les bandes en excès et remettez-les immédiatement à 2 ~ 8℃ pour le stockage 9.2.3 La solution de dilution de l'échantillon (10×), la solution de lavage concentrée (20×) sont diluées dans la solution de travail (dilué avec de l'eau distillée ou de l'eau déminéralisée) 9.2.4 Ajouter 50 µl de solution étalon 0,0ppb au godet B0 9.2.5 Ajouter 50μl de solution étalon à chaque puits étalon 9.2.6 Ajouter 50 µl de solution d'échantillon à chaque puits d'échantillon 9.2.7 Ajouter 50 µl de conjugué enzymatique anticorps anti-fipronil dans tous les puits 9.2.8 Agiter doucement le plateau de réaction pendant quelques secondes. 9.337 bain chaud pendant 30 minutes (tapoter de temps en temps sur la plaque de réaction pendant le bain chaud peut réduire l'erreur de double trou) 9.3.1 Secouer le liquide dans les puits, laver la microplaque 5 fois avec de la lotion, et tapoter une dernière fois sur du papier absorbant pour éliminer complètement le liquide dans les puits. 9.4 Réaction 9.4.1 Une fois la procédure de lavage terminée, utilisez immédiatement une micropipette pour ajouter 50 µl de solution chromogène A puis 50 µl de solution chromogène B dans chaque micropuits ; secouez légèrement la plaque de réaction pour bien la mélanger 9.4.237℃ bain chaud pendant 10min 9.4.3 Ajouter 50 µl de solution d'arrêt dans chaque puits et bien mélanger 9.4.4 Détecter l'absorbance à 450 nm et lire le résultat dans les 5 minutes. 10 Calcul du résultat 10.1 Analyse quantitative 10.1.1 La valeur moyenne (B) de la valeur d'absorbance de chaque solution étalon de concentration et échantillon obtenu est divisée par la valeur d'absorbance (B0) du premier étalon (0 étalon) et multipliée par 100 %, qui est la valeur d'absorbance en pourcentage. . B—valeur d'absorbance moyenne de la solution standard ou de la solution échantillon B0—valeur d'absorbance moyenne de la solution standard 0ppb 10.1.2 Utilisez la valeur logarithmique de la concentration de fipronil comme axe X et la valeur en pourcentage d'absorbance comme axe Y pour tracer une courbe standard. Selon la valeur en pourcentage d'absorbance de l'échantillon, l'abscisse du point correspondant peut être obtenue à partir de la courbe, qui est le logarithme de la concentration en fipronil, et l'antilog est la concentration en fipronil C (ppb) dans la solution de mesure 10.1.3 L'échantillon ayant été pré-dilué, la concentration de l'échantillon obtenue à partir de la courbe étalon doit être multipliée par son facteur de dilution. 10.2 Détermination semi-quantitative 10.1.1 Détermination semi-quantitative visuelle : tout d'abord, sélectionnez une solution standard appropriée et exécutez-la avec l'échantillon, et jugez si la valeur de concentration de l'échantillon est inférieure ou supérieure à la valeur standard en fonction de la comparaison des couleurs entre l'échantillon et la norme . 10.1.2 Mesure semi-quantitative de l'instrument : sélectionnez d'abord une solution standard appropriée et analysez-la avec l'échantillon, et jugez si la valeur de concentration de l'échantillon est inférieure ou supérieure à la valeur standard en fonction de la comparaison des valeurs d'absorbance de l'échantillon et de l'étalon. 11 spécificité Substance Réaction croisée fipronil 100% 12 paramètres du kit La limite inférieure de détection de ce kit est de 0,05 ppb. La meilleure valeur d'absorbance de B0 doit être supérieure à 1,0 L'erreur au sein de la plaque d'absorbance du kit est inférieure à 8 % et l'erreur entre les plaques est inférieure à 15 %. Le taux de récupération de la méthode d'extraction d'échantillons de tissus fournie dans ce manuel est supérieur à 80 %. 13 La plage de courbe standard fournie par le kit est de 0,1 ppb à 8,1 ppb. 14 Limites de l'analyse Les échantillons testés positifs par ce kit doivent être confirmés par une autre méthode telle que HPLC ou GC/MS.

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